Evaluation of a Chelex 100-based DNA extraction procedure for morphologically identified adult cyathostomins

Cyathostomins (Nematoda: Strongylida: Cyathostominae) are common gastrointestinal nematodes of horses and comprise a taxonomically diverse group. The aim of the study was to evaluate an adapted Chelex 100-based procedure for DNA extraction from individual morphologically identified adult cyathostomins and to assess the yield and spectrophotometric characteristics of the obtained DNA. Eleven adult cyathostomins were morphologically identified and processed individually. DNA concentration and absorbance ratios A260/A280 and A260/A230 were determined by microvolume spectrophotometry. Measurable nucleic acid was obtained from all 11 specimens. DNA concentrations ranged from 1.9 to 106.6 ng/µL, with a median of 12.5 ng/µL and a mean of 29.9 ng/µL. The A260/A280 ratio ranged from 1.80 to 6.33; the median value was 1.97, and six of the eleven extracts had values between 1.80 and 2.00. The extracts were additionally tested by PCR. Amplification was obtained from the prepared DNA samples, confirming the presence of amplifiable template. The Chelex 100/proteinase K procedure provided DNA from individually processed, morphologically identified adult cyathostomins without column purification or organic solvents and with a limited number of sample-transfer steps. The method can be used as a simple preparatory approach in studies combining morphological identification of individual cyathostomins with molecular genetic analysis.

Циатостомины (Nematoda: Strongylida: Cyathostominae) являются распространенными желудочно-кишечными нематодами лошадей и представляют собой таксономически разнообразную группу. Цель исследования состояла в оценке адаптированной методики выделения ДНК на основе Chelex 100 из отдельных морфологически идентифицированных половозрелых циатостомин, а также выхода и спектрофотометрических характеристик полученной ДНК. Одиннадцать половозрелых циатостомин были морфологически идентифицированы и обработаны по отдельности. Концентрацию ДНК и отношения оптических плотностей A260/A280 и A260/A230 определяли методом микрообъемной спектрофотометрии. Нуклеиновая кислота в измеримом количестве была получена из всех 11 экземпляров. Концентрация ДНК составляла от 1,9 до 106,6 нг/мкл (медиана — 12,5 нг/мкл, среднее значение — 29,9 нг/мкл). Отношение A260/A280 варьировало от 1,80 до 6,33; медиана составила 1,97, а у шести из одиннадцати экстрактов значения находились в пределах от 1,80 до 2,00. Экстракты дополнительно исследовали методом ПЦР. При использовании подготовленных образцов ДНК была получена амплификация, что подтверждает наличие амплифицируемой матрицы. Методика с применением Chelex 100 и протеиназы К позволила получить ДНК из индивидуально обработанных морфологически идентифицированных половозрелых циатостомин без очистки на колонках и без органических растворителей, при ограниченном числе этапов переноса образца. Метод может применяться как простой способ пробоподготовки в исследованиях, сочетающих морфологическую идентификацию отдельных циатостомин с молекулярно-генетическим анализом.

Siatostominlar (Nematoda: Strongylida: Cyathostominae) otlarning keng tarqalgan oshqozon-ichak nematodalari bo‘lib, taksonomik jihatdan xilma-xil guruhni tashkil etadi. Tadqiqotning maqsadi morfologik jihatdan identifikatsiya qilingan alohida voyaga yetgan siatostominlardan DNK ajratib olishning Chelex 100 asosidagi moslashtirilgan usulini baholash hamda olingan DNK miqdori va spektrofotometrik ko‘rsatkichlarini aniqlashdan iborat bo‘ldi. O‘n bitta voyaga yetgan siatostomin morfologik jihatdan identifikatsiya qilindi va ularning har biriga alohida ishlov berildi. DNK konsentratsiyasi hamda A260/A280 va A260/A230 optik zichlik nisbatlari mikrohajmli spektrofotometriya usulida aniqlandi. Barcha 11 ta ekzemplyardan o‘lchash mumkin bo‘lgan miqdorda nuklein kislota olindi. DNK konsentratsiyasi 1,9–106,6 ng/mkl oralig‘ida bo‘lib, mediana 12,5 ng/mkl, o‘rtacha qiymat esa 29,9 ng/mkl bo‘ldi. A260/A280 nisbati 1,80–6,33 oralig‘ida o‘zgardi; mediana 1,97 bo‘lib, o‘n bitta ekstraktdan oltitasida bu ko‘rsatkich 1,80–2,00 oralig‘ida qayd etildi. Ekstraktlar qo‘shimcha ravishda PZR usulida tekshirildi. Tayyorlangan DNK namunalarida amplifikatsiya kuzatildi, bu esa amplifikatsiyaga yaroqli DNK matritsasi mavjudligini tasdiqladi. Chelex 100/proteinaza K usuli alohida ishlov berilgan, morfologik jihatdan identifikatsiya qilingan voyaga yetgan siatostominlardan kolonkada tozalash va organik erituvchilarni qo‘llamasdan, namunani ko‘chirish bosqichlari soni cheklangan holda DNK olish imkonini berdi. Ushbu metoddan alohida siatostominlarni morfologik identifikatsiya qilish va molekulyar-genetik tahlilni birlashtirgan tadqiqotlarda namunani tayyorlashning oddiy usuli sifatida foydalanish mumkin.